@list L1:level2 {mso-bidi-font-family:"Times New Roman";}

KROMATOGRAFISKA METODER

Elin Lehnbom

Biologiskt aktiva naturprodukter i läkemedelsutveckling 5 p, HT-04

Institutionen för läkemedelskemi, Avdelningen för farmakognosi

Uppsala universitet

 

Inledning

Kromatografi är en metod som används för att separera, isolera, identifiera och kvantifiera substanser i en blandning. Ordet kromatografi kommer från grekiska chroma som betyder färg och grafia som betyder skriva. Det var en rysk botanist vid namn M. S. Tswett som 1903 beskrev tekniken bakom kromatografi för första gången. Han använde vätskekromatografi för att separera olika klorofyll och de färgade substanserna gav namn åt tekniken kromatografi. Tekniken beskrivs först igen 1940 när britterna A. Martin och R. Synge publicerar sina grundläggande studier kring vätskekromatografi, som de 1952 får nobelpriset i kemi för. Samma år, 1952, beskriver A. Martin och A.T. James gaskromatografin (1, 2, 3).

 

Kromatografi

Det finns många olika sorters kromatografiska metoder. Gemensamt för alla är att de består av två faser, en mobil och en stationär fas. Blandningen man vill undersöka löser sig i den mobila fasen som antigen är en gas, vätska eller superkritisk vätska. Den mobila fasen rör sig sedan medan den stationära fasen är immobil. De olika faserna väljs utifrån blandningens egenskaper, så att de ingående substanserna har olika löslighet i de båda faserna. Eftersom substanserna bara vandrar när de befinner sig i den mobila fasen, kommer substanser som löser sig bättre i den stationära fasen att vandra långsammare. Separationen beror på att de olika substanserna i en blandning binder olika hårt till den stationära fasen och kommer därför att ”vandra” olika snabbt med den mobila fasen (bild 1) (1, 4).

 

 

Bild 1. Schematisk bild på separering av en blandning.

 

 

De olika sorterna av de kromatografiska metoderna bygger på två olika metoder. Antingen används en kolonn där den stationära fasen finns i ett rör och den mobila fasen rör sig genom röret under tryck eller tack vare graviteten. Exempel på kolonnkroamtografi är vätskekromatografi (LC), gaskromatografi (GC) och superkritisk vätskekromatografi (SFC). Den andra metoden är plankromatografi där den stationära fasen finns på ett plant underlag eller på papper och den mobila fasen rör sig genom kapillärkraft eller graviteten, till exempel tunnskiktskromatografi (TLC) (1).

 

Kromatogram

Om en detektor, som kan mäta koncentrationerna, placerats i slutet av kolonnen kommer den att mäta koncentrationerna av de olika substanserna. De signaler som fås kan ritas i ett diagram som antigen funktion av tid eller volym av tillsatt mobil fas. Det kallas kromatogram och består av ett antal toppar, vilka kan användas för kvalitativa eller kvantitativa analyser (bild 2).

 

        

Bild 2. Exempel på kromatogram.

 

 

För att identifiera substanserna undersöker man efter vilken tid de kommer till detektorn och för att bestämma mängden av substanserna undersöker man arean under topparna (1).

 

Distribution

De ingående substanserna i blandningen kommer att distribueras jämt mellan de två faserna så att en jämvikt uppstår:

A mobil  A stationär

 

Jämviktskonstanten K definieras som koncentrationen av substansen i den stationära fasen dividerat med koncentrationen av substansen i den mobila fasen:

 

K=CS/CM

 

vilket innebär att K>0 för att substanserna ska separeras (4).

 

Retentionstid

Den tid det tar från att man tillsatt provet tills det vandrat genom kolonnen och registreras av detektorn kallas retentionstid (tR). Den tid det tar för den mobila fasen att vandra genom kolonnen benämns tM (bild 3).

 

shu.ac.uk/schools/sci/chem/tutorials/chrom/chrom1.htm

Bild 3. Retentionstid. tR = tiden för provet, tM = tiden för den mobila fasen.

 

För att beräkna vilken hastighet en substans vandrar genom kolonnen används retentionsfaktorn k´:

 

k´= tR * tM/ tM

 

Är retentionsfaktorn mindre än 1 har substansen vandrat så fort genom kolonnen att det är svårt att beräkna en exakt retentionstid. Retentionsfaktorer mellan 1 och 5 är optimala (4).

 

Bandbreddning

Substans A vandrar snabbare än substans B (bild 1), vilket beror på att substans B stannar längre i den stationära fasen än vad substans A gör. Mellanrummet mellan de båda substanserna ökar ju längre de vandrar, men samtidigt breddas även banden, vilket leder till lägre effektivitet. Ett kromatogram med symetriska och skarpa toppar tyder på en optimal separering. För att få en så bra separering som möjligt måste bandbreddningen minimeras.  För att minska bandbreddningen kan olika faktorer som påverkar bandbreddningen ändras tillexempel partikelstorlek, typ av mobilfas och packningen i kolonnen (1, 4).

 

Gaskromatografi

I gaskromatografi används en inert gas som mobil fas. Vanliga gaser som används är helium, argon eller kväve och de kallas även bärgas. Vilken gas som används bestäms efter vilken detektor man använder. Den stationära fasen bestäms utifrån de egenskaper substanserna som man vill separera har. Alla stationära faser bör vara kemiskt inerta och värmestabila. Eftersom en polär stationär fas separerar en polär substans bättre än en icke-polär, bör den stationära fasens polaritet ligga nära substansens polaritet. Den stationära fasen prepareras på en kolonn. Om den stationära fasen är en vätska kallas det gas-liquid chromatography (GLC) och är den i fast form kallas det gas-solid chromatography (GSC). Det sistnämnda är vanligast och brukar förkortas GC. Det finns två typer av kolonner; packade eller kapillär. En packad kolonn är gjord av glas, rostfritt stål, koppar eller aluminium. De är mellan 2-6 meter långa och diametern inuti kolonnen är cirka 2-4 mm. Kolonnen är fylld med små partiklar som substanserna absorberas av under vandringen genom kolonnen. Jämfört med kapillärkolonner klarar packade kolonner av att analysera större volymer, vanligen mellan 0,1-10 mL. De kapillära kolonnerna, eller öppna kolonner som de också kallas, är gjorda av kiseldioxid. Dessa kolonner kan vara upp till 100 meter långa och kan ha en diameter på 150-300 mm. Eftersom de har en mindre diameter klarar de inte av volymer större än 10-2 mL, men tack vare dess längd är de ändå effektivare på att separera substanser. 

Gaskromatografi kan användas för att separera komplexa blandningar på kort tid. För att kunna vandra genom kolonnen måste provet ha rätt koncentration, vara flyktigt och inte förstöras av temperaturen. Prover med för låga koncentrationer ger inget utslag och är koncentrationen för hög överbelastas kolonnen, vilket ger ett sämre resultat. Många organiska föreningar kan göras mer flyktiga genom att ta fram derivat av polära grupper tillexempel

–OH eller –COOH. 

Gaskromatografi kan även användas i laboratorier för kvantitativa analyser. Man kan tillexempel mäta halten alkohol i blodet med hjälp av gaskromatografi. För att bestämma koncentrationen av substansen beräknar man arean under toppen på kromatogrammet.

Dessutom kan gaskromatografi användas till kvalitativa analyser, vilket kan utnyttjas för att undersöka effektiviteten av en reningsprocess. Innehåller provet en eller flera föroreningar kommer dessa att synas som extra toppar på kromatogrammet (1, 3, 5). 

 

Vätskekromatografi

Som namnet antyder används en vätska som mobil fas i vätskekromatografi. Förr i tiden, före 1960, mätte de rör som användes till vätskekromatografi cirka 10-50 mm i diameter. Inuti röret fanns den stationära fasen i form av fasta partiklar, med en diameter på 150-200 mm, som preparerats med en adsorberande vätska. Flödeshastigheten i dessa kolonner var inte hög men alla försök att påskynda processen misslyckades. Det var inte förrän på 1960-talet man lyckades producera och använda partiklar med en diameter på 5-10 mm som packning. För att skilja den nya metoden från den gamla, benämndes den high-performance liquid chromatography (HPLC).

Gaskromatografins användning begränsas av att proverna som ska analyseras måste vara värmestabila och flyktiga. Prover som inte är flyktiga, tillexempel peptider och kolhydrater, måste först ändras kemiskt. Därför finns det en marknad även för vätskekromatografi för att separera substanser.

I HPLC vandrar provet genom en kolonn med hjälp av en vätska som utgör den mobila fasen. Kolonnerna som används är gjorda av rostfritt stål och är packade med partiklar av kiseldioxid. Kolonnerna är mellan 30-300 mm långa och har en innerdiametern på 2,1-4,6 mm. Livslängderna på kolonner förkortas av att vissa substanser binder irreversibelt till den stationära fasen och av att partiklar blockerar kolonnen. Därför brukar man placera en kortare och billigare kolonn (guard column) framför den kolonnen där separationen sker, för att öka livslängden och få ner kostnaderna.

Det finns flera olika HPCL-metoder. En av de mest använda är partitionkromatografi som används till polära blandningar med låg molekylvikt tillexempel antibiotika, steroider och analgetika. Adsorptionskromatografi är en annan metod som främst används till opolära, hydrofoba organiska föreningar. En fördel med adsorptionskromatografi är dess förmåga att analysera isomerer. Jonbyteskromatografi används ofta för kvantitativa undersökningar av både organiska och oorganiska föreningar. För att separera ut stora molekyler till exempel proteiner eller bestämma molekylvikten för en substans kan man använda gelkromatografi. Den stationära fasen består av partiklar med små porer som de stora molekylerna inte kommer in i. De kommer därför att snabbt vandra genom kolonnen, medan de mindre molekylerna kommer in i porerna och behöver längre tid på sig att vandra (1, 3, 5).  

 

Superkritisk vätskekromatografi

Trots den utbredda användningen av gaskromatografi och vätskekromatografi kan de inte användas för att separera alla typer av prover. Gaskromatografins fördelar är en snabb separation, men dess användning begränsas till prover med vissa egenskaper. Vätskekromatografin kan användas till ett större antal prover, men nackdelen där är att de detektorer som används inte är lika känsliga som de detektorer som används vid gaskromatografi. Därför kan man till vissa prover behöva använda superkritisk vätskekromatografi. Den mobila fasen består av en superkritisk vätska. Om en gas värms upp och utsätts för högre tryck än dess kritiska läge fås en superkritisk vätska, vilken inte går att kondensera till vätska igen. I en superkritisk vätska rör sig molekylerna oberoende av varandra, precis som de gör i gasform. Trots det har superkritiska vätskor andra egenskaper än vad de har i sin gas- eller vätskeform. Densiteten för en superkritisk vätska ökar drastiskt jämfört med dess gasform och kommer nästan upp i samma densitet som i sin vätskeform. Tack vare dess höga densitet har den superkritiska vätskan förmåga att lösa upp stora molekyler som är svåra att förånga. De kritiska temperaturerna för vätskor varierar mellan 30°C och 200°C och det är med fördel som de vätskor med lägre kritiska temperaturer används tillexempel koldioxid. Superkritiska vätskor liknar gaser i avseende på viskositet, vilket medför att de kan vandra genom kolonnen utan det höga trycket som är nödvändigt i HPLC.      

Apparaturen för superkritisk vätskekromatografi påminner om den som används till vätskekromatografi. Kolonnerna som används kan både vara packade eller öppna kolonner. De packade kolonnerna klarar av större volymer och är mer effektiva. Eftersom viskositeten är lägre hos superkritiska vätskor kan längre kolonner användas. För riktigt svåra separationer har kolonner så långa som 60 m använts. En annan fördel med superkritisk vätskekromatografi är att de känsliga detektorerna som används till gaskromatografi även går att användas till superkritisk vätskekromatografi. Superkritiska vätskor har egenskaper som påminner både om de egenskaper som substansen har i både gas- och vätskeform. När superkritisk vätskekromatografi används får man därför fördelarna från både gaskromatografi och vätskekromatografi. Därför används superkritisk vätskekromatografi till substanser som är värmekänsliga och svåra att förånga (1, 5).

 

Tunnskiktskromatografi

Tunnskiktskromatografi är en plankromatografisk metod där den mobila fasen rör sig genom den stationära fasen med kapillärkraft och ibland även graviteten. Teoretiskt sett är tunnskiktskromatografi och vätskekromatografi väldigt lika. Genom att först göra en tunnskiktskromatografi, som sedan följs upp med en vätskekromatografi, kan proceduren utföras snabbare och kostar mindre. De flesta separationer utförs på en glasskiva som preparerats med ett tunt lager partiklar, vilket utgör den stationära fasen. Genom att droppa en droppe av provet man vill undersöka i ett hörn på skivan och markera läget kan man sedan när droppen torkat, lägga skivan i en sluten behållare. Till behållaren tillsätts sedan en lösning som ena delen av skivan får stå i. När lösningen sedan vandrat uppför ungefär halva skivan tar man ur skivan ur behållaren och låter den torka. Därefter kan man bestämma lägena för de olika substanserna. Det finns flera olika metoder för att bestämma läget på substanserna efter att man har separerat dem. En vanlig metod är att spraya med tillexempel en jodlösning. Jodlösningen reagerar med organiska substanser och bildar mörka fläckar. Det finns flera fördelar med tunnskiktskromatografi. Tillexempel sker separeringen sker snabbt och med olika färgningar kan de separerade substanserna lätt identifieras. Dessutom kan de intorkade substanserna skrapas upp och analyseras (1, 3).

 

Referens

  1. DA Skoog, DM West, FJ Holler. Fundamental of analytical chemistry. 7th Ed, 1996. Sanders college publishing.
  2. Nationalencyklopedin.
  3. T Stigbrand (red.). Grundläggande kemi för medicinsk och biovetenskaplig utbildning. 2. uppl, 1990. Almqvist & Wiksell.
  4. http://www.shu.ac.uk/schools/sci/chem/tutorials/chrom/chrom1.htm
  5. D Harvey. Modern analytical chemistry. 2000. McGraw-Hill.